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紫外法对DNA熔解温度(Tm)的测定 紫外可见分光光度计UV7配备恒温器

来源:仪器仪表网  作者:张大摄   2021-09-22 08:25:38 阅读:6                  
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  【仪器仪表网  专题推荐】人世间生灵都对温度十分敏感。温度变化影响着天地万物生息,造成了苍穹大地间的千姿百态。古往今来,对于温度的调节和热量的运用,也在人类生活生产中扮演了非常重要的角色。在生命科学研究领域,紫外法对DNA熔解温度(Tm)的测定,可以借助梅特勒紫外可见分光光度计UV7配备酷T(CuveT)恒温器。

紫外可见分光光度计UV7配备酷T(CuveT)恒温器

  天然状态的DNA,在比较高的温度下会发生熔解(又称变性):双链DNA(dsDNA)解链为单链DNA(ssDNA),且变为无规则线团。DNA熔解温度(melting temperature, Tm)是使DNA双螺旋结构解开一半时所需要的温度。DNA的变性从开始解链到完全解链,是在一个相当小的温度范围内完成的。并且,在光学性质上会产生“增色效应”,即紫外吸收值升高。所以,我们可以利用紫外可见分光光度计检测DNA样品在260nm处吸光度随温度的变化,对解链过程进行监测。

  不同种类DNA的Tm值不同:这是由于鸟嘌呤-胞嘧啶(G≡C)核苷酸之间有3个氢键,而腺嘌呤-胸腺嘧啶(A=T)之间有2个氢键,G≡C核苷酸解离所需能量大于A=T碱基对所需能量。所以,dsDNA中鸟嘌呤-胞嘧啶碱基对(G≡C)含量越高,其熔解温度(Tm)就越高。由此可见,熔解温度(Tm)可指示不同DNA样品的碱基组成,即G≡C与A=T的比例。

  在以下示例实验中,使用仪器仪表网设备-梅特勒-托利多紫外可见分光光度计UV7配备酷T(CuveT)恒温器,测定20℃-95℃升温范围内鲑鱼精DNA在260nm处的吸光度变化,以监测其变性过程。我们用各温度点测得的吸光度绘制图谱,可得到一条温度-吸光度S形曲线,如下图所示:

温度-吸光度S形曲线

  在此实验案例中,鲑鱼精DNA的Tm值通过确定S形曲线的拐点来确定。经测定和计算,鲑鱼精DNA的Tm值为64.4℃,说明其G≡C碱基对的浓度相对较低。确定熔解温度的另外一种方法是用切线法对S形曲线的拐点进行图形化评估。

  综上所述,梅特勒-托利多超越系列紫外可见分光光度计可搭载酷T帕尔贴控温系统或劳达(LAUDA)等水浴恒温系统,实现了对样品精确快捷的温度控制。


 
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